北师大版高中生物选修2:生物科学与社会基因诊断

发布时间:2021-10-18 14:34:53

基因诊断 Gene Diagnosis ? 疾病的根本原因: 疾病的各种表型的改变 是基因的改变造成的。 基因诊断(Gene Diagnosis)的含义 ? 基因诊断: 采用分子生物学的技术方法来分析 受检者的某一特定基因的结构(DNA水*) 或功能(RNA水*)是否异常,以此来对 相应的疾病进行诊断,是病因的诊断。 检查基因的存在、缺陷或表达异常,对人体状态 和疾病作出诊断的方法和过程。 基因诊断的原理 1、基因诊断的原理: ? DNA诊断----检测相关基因的结构及其表 达功能是否正常。 ? RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表 达的分析。 基因诊断的技术方法 一、基因诊断中常用的 分子生物学技术 ㈠ 核酸分子杂交 ㈡ PCR ㈢ SSCP(PCR-SSCP) ㈣ 限制酶酶谱分析 ㈤ DNA序列测定 ㈥ DNA芯片技术 核酸分子杂交:按照碱基互补配对原则,将不同来 源的序列互补单链的DNA/DNA,RNA/RNA,互补配对 成双链杂交分子,这一过程叫核酸分子杂交。 一、原位分子杂交技术 DNA变性: 当溶液中的DNA分子处于高温或高pH值(13)条件下, 维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA双链解离 成两条单链,这一过程叫DNA变性。 DNA复性: 当温度降低至合适温度或恢复pH值至中性,两条裂 解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一 过程叫DNA复性,又叫DNA杂交。 原位杂交:用核苷酸探针对特殊的核苷酸顺序在其原 位进行(in situ hybridization)杂交,叫原位杂交。可用 于DNA、RNA定位研究。 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH) 印迹技术的类别及应用 (一)DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。(不仅可以检出特异的DNA片段,而且能进行定 位和测定分子量,可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分 析等) (二)RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 (三)蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Southern 印迹杂交用于基因探测的基本过程 Southern印迹杂交常用于探测DNA的限制性内切 酶图谱。通过检测某个体特定基因及旁侧区域限制性 内切酶图谱的变化,可判断是否发生了明显的DNA 突变。具体方法图示如下: 含已知基因的重组质粒菌株 质粒DNA 限制酶酶解及电泳分离 组织或细胞 基因组DNA 限制酶酶解及电泳分离 回收含已知基因的DNA片段 转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 标记的探针 杂交 洗膜 预杂交 放射自显影 图 用Southern 印迹杂交方法进行基因诊断的基本步骤 ② ③ ① 分子杂交实验 放 射 自 显 影 照 片 核酸分子杂交 制 制 备 备 杂 检 样 探 交 测 品 针 获得满意的高特异性杂交的关键是 控制好杂交条件和杂交后冲洗条件 杂交双链的稳定程度主要由其Tm值(熔解温度) 决定。影响杂交双链Tm值的因素包括以下几个方面: ? 1)杂交双链的碱基组成。GC含量越高, Tm越高。 ? 2)杂交双链的长度。越长,Tm越高。 ? 3)杂交双链的碱基错配程度。错配程度越 低,Tm越高。 ? 4)溶液中的离子强度。离子强度越高, Tm越高。 ? 5)变性剂(如常用的甲酰胺)的影响。甲 酰胺浓度越高,Tm越高。 在液相体系中,完全配对的核酸双链的Tm值可以下列公式估计: DNA/DNA Tm(0C)=81.5 + 0.41×(G-C)% + 16.6×logM - 0.63 ×甲酰胺(%) - 600/L DNA/RNA Tm(0C)=79.8 + 0.58×(G-C)% + 18.5×logM + 11.8 [(G-C)%]2 - 0.50×甲酰 胺(%) - 820/L RNA/RNA Tm(0C)=79.8 + 0.58×(G-C)% + 18.5×logM + 11.8 [(G-C)%]2- 0.35×甲酰胺(%) - 820/L 寡聚核苷酸 Tm(0C)=2(AT碱基对数)+ 4(GC碱基对数) (适用于10~30bp) Tm(0C)=81.5 + 0.41×(G-C)% + 16.6×logM-600/L (适用于14~70bp) 其中M为单价阳离子(通常为Na+)浓度, L为杂 交双链的长度,以碱基对计算。这些公式适用于 0.01~0.4mol/L Na+浓度及30-75GC%。 在无变性剂存在的条件下,最适杂交发生在比 DNA/DNA Tm低20-250C,比DNA/RNA Tm 低10- 150C。 在固液体系中,杂交条件对杂交双链Tm值的影响 更为复杂,一般低于按上述公式得到的计算值。 (二) 聚合酶链式反应 ( PCR polymerase chain reaction) 又叫体外基因扩增技术。 利用人工合成的一对引物, 在被扩增DNA模板链的两端 形成双链,由DNA聚合酶催 化一对引物之间的聚合反应。 具体过程: ① 变性:将双链DNA加热(95℃)使之变性,DNA双链 变成单链。 ② 退火:降低温度至56℃使引物与模板DNA单链结合。 ③ 延伸:将温度升至72℃,在DNA聚合酶作用下,在引 物3’端进行延伸,使原模板DNA的一条链变成 两条链。 (1)基本工作原理 Template DNA 5? 5? 5? Cycle 1 Primer 1 5? Primer 2 5? 5? 5? 5? Cycle 2 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5?

相关文档

  • 北师大版高中生物选修2:生物科学与社会转基因育种
  • 北师大版高中生物选修2:生物科学与社会绿色消费
  • 猜你喜欢

    电脑版